Technologia sekwencjonowania nowej generacji
Przygotowanie próbek
Wyposażenie laboratorium
Sekwencjonowanie Nowej Generacji (NGS)
Sekwencjonowanie nowej generacji obejmuje wszystkie innowacyjne technologie sekwencjonowania o dużej przepustowości w jednym cyklu eksperymentu. Technologie NGS opierają się na równoległym sekwencjonowaniu fragmentów materiału genetycznego. Wobec tego pozwalają na sekwencjonowanie DNA i RNA znacznie szybciej i taniej (kilka rzędów wielkości) niż wcześniej stosowane metody Sanger.
Etapy NGS:
-
1
Hybrydyzacjaekstrakcja i oczyszczenie RNA -
2
Przygotowanie bibliotekwzbogacanie, systeza cDNA, ligacja adapterów
-
3
Sekwencjonowaniesekwencjonowanie bibliotek przy użyciu sekwenatora NGS
-
4
Analiza uzyskanych danychtrimowanie, filtrowanie i mapowanie odczytów, przygotowanie dodatkowych analiz
Technologie sekwencjonowania
Sekwencjonowanie przez syntezę (SBS)
Wykorzystujemy technologię SBS z odwracalną terminacją (Illumina), która obecnie jest najbardziej wydajną i najczęściej stosowaną technologią (ponad 90% danych z sekwencjonowania). Przeprowadzamy tzw. sekwencjonowanie 2-kanałowe SBS, dzięki któremu czas procedury oraz jej koszty są zredukowane zapewniając jednocześnie wyższą jakość i dokładność w stosunku do sekwencjonowania jednokanałowego.
Przygotowanie próbek do sekwencjonowania NGS
Materiałem wyjściowym do procedury może być jedynie totalny RNA lub genomowy DNA spełniający parametry dla danej usługi dotyczące: objętości próbki, koncentracji, ilości materiału, czystości i jakości. Poniżej przedstawiamy niezbędne wymagania dla próbek biologicznych i sposób ich przygotowania do sekwencjonowania w Genomika Polska.
Wymagania dla prób do sekwencjonowania
Sekwencjonowanie RNA
Sekwencjonowanie DNA
*Opcjonalne, jeśli jest możliwość zmierzenia, wartości podane dla RNA ssaków, w przypadku innych organizmów prosimy o kontakt.
Wymagania:
- Materiał stanowić może jedynie totalny RNA lub genomowy DNA spełniający określone parametry dla danej usługi dotyczące: objętości próbki, koncentracji, ilości materiału, czystości i jakości.
- RNA i DNA powinien zostać zawieszony w wysokiej jakości wodzie wolnej od nukleaz o pH w granicach 7,0–8,5 lub buforze elucyjnym wolnym od nukleaz z zawartością 10 mM Tris-Hcl o pH 7,5–8,5 bez EDTA.
- Próbki należy wysłać w probówkach 1,5 mL typu eppendorf lub 0,2 mL probówkach do PCR w paskach (stripy), odpowiednio unieruchomionych – np. w pudełku lub na statywie, celem uniknięcia popękania probówek podczas transportu. Genomowy DNA należy przesłać w probówkach typu DNA LoBind o zmniejszonym przyleganiu próbki do powierzchni. RNA należy przesłać w probówkach wolnych od RNaz.
- Każda próbka musi zostać dokładnie zamknięta, a brzegi wieczka należy owinąć parafilmem.
- Próbki muszą zostać na wieczku trwale oznaczone czteroznakowym ID odpowiadającym ID zawartemu w dołączonym arkuszu “sample_sheet”. Dodatkowo ID należy umieścić także na bokach probówek. W przypadku probówek do PCR w paskach (stripy) zamykanych jednym połączonym wieczkiem koniecznie jest opisanie probówek z boku.
- Próbki muszą zostać umieszczone w statywie lub pudełku dokładnie w tej samej kolejności, jaka widnieje w arkuszu “sample_sheet”
- Przed wysyłką próbek zalecamy ich głębokie zamrożenie.
- Próbki muszą być wysłane w styropianowym pudle wypełnionym suchym lodem. Ilość suchego lodu musi wystarczyć, aby próbki nie uległy rozmrożeniu przed dostarczeniem ich do laboratorium. Za warunki transportu odpowiada klient.
- Do przesyłki należy dołączyć wydrukowany arkusz “sample_sheet” zawierający wszystkie wymagane informacje, wraz z numerem zamówienia. Pudełko należy z wierzchu również opisać numerem zamówienia.
Sekwencjonowanie SBS (Illumina)
Najbardziej popularnymi i niezawodnymi systemami NGS są sekwenatory Illumina działające w oparciu o technologię sekwencjonowania przez syntezę (SBS). Technologia SBS polega na zastosowania odwracalnego terminatora wbudowanego w nukleotydy umożliwiającego jego detekcję. Aparaty reprezentują w pełni automatyczny i zintegrowany system do sekwencjonowania, zawierający m.in. zestawy do przygotowania bibliotek, automatyczną analizę danych.
NovaSeq 6000 Sequencing System
Opis
Urządzenie NovaSeq 6000 jest najmocniejszym, skalowanym i elastycznym urządzeniem firmy Illumina. Sprzęt został stworzony do zastosowań wymagających analizy dużej ilości danych. Jest kompatybilny z zestawami do przygotowania bibliotek Illumina i zapewnia wyjątkową jakość danych. System do sekwencjonowania NGS NovaSeq 6000 firmy Illumina wykorzystuje niezawodną technologię sekwencjonowania przez syntezę (sequencing by synthesis – SBS) oraz technologię uporządkowanego wzoru flow cell. Umożliwia analizę jednej lub dwóch flow cell jednocześnie i wybór pomiędzy czterema rodzajami flow cell.
Specyfikacja
Sekwenator NGS MiSeq:
Opis
System MiSeq zapewnia optymalną moc i pewność sekwencjonowania nowej generacji (NGS) w sekwencerze stacjonarnym o niewielkich gabarytach. Wysoka dokładność odczytów oraz niska cena czynią aparat idealnym narzędziem do szybkiej analizy genetycznej.
MiSeq stworzony został z myślą o:
- sekwencjonowaniu celowanym,
- metagenomice,
- sekwencjonowaniu małych genomów,
- celowanej ekspresji genów,
- sekwencjonowaniu amplikonów czy analizie HLA.
- rearanżacji chromosomalnej
Podobnie jak w przypadku Serii NovaSeq aparat MiSeq wykorzystuje sprawdzoną technologię sekwencjonowania SBS. Aparat umożliwia uzyskanie wyników w ciągu kilku godzin.
Specyfikacja
