RNAseq-raport

Analiza Ekspresji Genów RNA-seq

1. Statystyki próbek

Suma odczytów

Histogram przedstawia sumę wszystkich odczytów w odniesieniu dla zmapowanych genów. W przypadku surowych danych można zaobserwować, że każda próbka ma inną liczbę odczytów. Niektóre próbki mogą posiadać więcej odczytów co nie koniecznie oznacza większą ekspresję.
Różnice mogą wynikać z głębokości sekwencjonowania (większa liczba odczytów) jak również długości genów (dłuższe geny będą miały więcej odczytów).
Ze względu na występowanie dysproporcji w liczbie odczytów pomiędzy próbkami, przed dalszą analizą ekspresji genów istnieje konieczność wykonania normalizacji danych.

Wykres gęstości ekspresji genów

Po wstępnej selekcji danych (mającej na celu usunięcie genów o niskich odczytach) oraz normalizowaniu odczytów zastosowano tranformację logarytmiczną. Transformacje logarytmiczne wykorzystuje się w celu odwzorowania różnic ekspresji genów (w przypadku surowych danych taka analiza jest niemożliwa).
Wartości w tej skali są bezwymiarowe, a najczęściej wykorzystywanym przekształceniem jest logarytm o podstawie 2 (log₂). Taką funkcją jest rlog, która przed przekształceniem log2 dodatkowo normalizuje dane (przekształca dane minimalizując różnice między próbkami dla wierszy o małych zliczeniach oraz normalizuje zliczenia w odniesieniu do wielkości biblioteki).

Poniższy wykres przedstawia ekspresję funkcji gęstości. Funkcja gęstości profili ekspresji genów określa w jaki sposób geny wykazują ekspresję (dla danej próbki). Przyjmuje się, że dla danych znormalizowanych wykresy gęstości badanych próbek powinny się pokrywać - świadczy to o podobnej dystrybucji odczytów.

Interpretacja wykresu:

• Zakres ekspresji od -1 do +1 opisuje geny nie wykazujące zmian w ekspresji. W tym przedziale zazwyczaj obserwuje się maksimum funkcji.
• Zakres ekspresji od +1 opisuje geny wykazujące ekspresję rosnącą wraz ze skalą. W tym przedziale zazwyczaj można zaobserwować lokalne maksimum funkcji.

2. Podobieństwo pomiędzy próbkami

Aby zbadać podobieństwo próbek przeprowadzono kontrolę jakości przy użyciu analizy głównych składowych (PCA) oraz hierarchicznych metod klastrowania. Analiza jakości na poziomie próbki pozwala zobaczyć jak dobrze powtórzenia z jednej grupy eksperymentalnej układają się razem, a także sprawdzić czy warunki eksperymentalne stanowią główne źródło zmienności danych. Dzięki kontroli jakości można zidentyfikować również wartości odstające, które mogą wymagać dalszego zbadania przed analizą zróżnicowanej ekspresji.

PCA

Analiza głownych składowych (PCA) genów w badanej populacji.
Wynikiem analizy jest wykres przedstawiający zależności/różnice pomiędzy próbkami (przedstawionymi jako indywidualne kropki) jak również pomiędzy grupami (każda grupa reprezentowana przez elipsę).

Korelacja pomiędzy próbkami

Macierz korelacji pomiędzy próbkami daje przegląd podobieństw i różnic między próbkami. Które próbki są do siebie podobne, a które się różnią?

Pożądanym wynikiem jest, aby próbki z jednej grupy miały większy stopień korelacji niż te z różnych grup.

3. Analiza Ekspresji Genów

Wykresy poniżej przedstawiają rozkład ekspresji genów dla dwóch porównywanych grup. W celu selekcji najbardziej zróżnicowanych ekspresji pomiędzy grupami zastosowano dwa filtry:

• skorygowana wartość p < 0,05
• zmiana ekspresji LFC ≤ -1 oraz LFC ≥ +1

Oś x “Ekspresja [LFC]” - opisuje zmianę ekspresji genów w skali log₂ Oś y “Skorygowana wartość p” - przedstawiaja zmianę wartości p w skali -log₁₀

Rozkład danych przedstawiono w postaci dwóch wykresów:

• Wykres typu punktowy
• Wykres typu wulkan

Obszar szary charakteryzuje geny, które nie wykazują zmian w ekspresji pomiędzy badanymi grupami. Geny o podwyższonej ekspresji względem drugiej grupy oznaczone są kolorem czerwonym, analogicznie kolor niebieski oznacza geny o obniżonej ekspresji względem porównywanej grupy. Im dalej dany gen (kropka) znajduje się od przekątnej oznaczonej kolorem szarym tym ekspresja tego genu jest odpowienio niższa lub wyższa.

Grupa GL vs Con

Wykres Punktowy

Wykresy Analizy Ekspresji Genów (każda kropka charakteryzuje jeden gen).

Wykres typu Wulkan

Wykresy Analizy Ekspresji Genów (każda kropka charakteryzuje jeden gen).

Tabela

Tabele przedstawiają 10 genów, które wykazują najsilniejsze zmiany w poszczególnych porównaniach grup.

Wytłumaczenie danych zawartych w zbiorczych tabelach:

• baseMean - średnia ze znormalizowanych wartości zliczeń
• log2FoldChange - oszacowanie wielkości efektu. Zmienna ta mówi, jak bardzo ekspresja genu zmieniła się w jednej grupie w stosunku do drugiej. Wartość ta jest przedstawiona w skali logarytmicznej do podstawy 2: na przykład log2 krotność zmiany 1,5 oznacza, że ekspresja genu jest zwiększana przez współczynnik wynoszący 2^1,5, czyli w przybliżeniu zmiana wynosi 2,82.
• lfcSE - szacowana wartość błędu dla log2 fold change
• p-value - p wartość dla log2 fold change
• padj - skorygowana p wartość

Tabela z genami o obniżonej ekspresji

Tabela z genami o podwyższonej ekspresji

Szlak Sygnałowy

Szlak sygnałowy opisuje szereg życiowych procesów biochemicznych pochodzącymi zarówno z zewnątrz jak i wewnętrza komórki.

Przedstawione poniżej ścieżki sygnałowe pochodzą z bazy danych KEGG (ang. Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes). Ilustracje KEGG Pathway zawierają informacje na temat sieci komórkowych interakcji molekularnych i ich wariantów na podstawie publikacji naukowych.

Pełna nazwa szlaku sygnałowego znajduje się w lewym górym rogu.

Rodzaje KEGG Pathway:

• Metabolizm
• Przetwarzanie Informacji Genetycznej
• Przetwarzanie Informacji ze Środowiska
• Procesy na Poziomie Komórki
• Procesy na Poziomie Organizmu
• Procesy Chorobotwórcze
• Projektowanie Leków

Wykres szlaku sygnałowego wykonywany jest ręcznie w oprogramowanu o nazwie KegSketch. Domyślnie każda mapa stanowi interaktyny szablon. Referencyjne mapy KEGG Pathway oznaczone są kolorem białym. Zmiany przedstawiane są za pomocą palety kolorów, np. zielony i czerwony ozanczają kolejno zmiejszoną i zwiększoną ekspresję.

Interaktywną i szczegółową interpretację ścieżki KEGG można znaleźć w bazie KEGG Pathway po podaniu pełnej nazwy ścieżki lub ID.

Interpretacja KEGG

Podwyższona Ekspresja

Obniżona Ekspresja

Ontologia genów

Baza GO skupia całą dotychczasową wiedze o genach z podziałem na 3 domeny: elementy komórkowe (CC), funkcje molekularne genów (MF) oraz procesy biologiczne, w których uczestniczą (BP).
Ontologię genów stusuje się do lepszego zrozumienia procesów biologicznych czy też profilu funkcjonalnego zestawu genów ulegających zróżnicowanej ekspresji w badanych warunkach. Ontologia genów może być zwizualizowana w następujący sposób:

• Wykres słupkowy jest najczęściej stosowaną metodą wizualizacji wzbogaconych terminów.
• Wykres punktowy również przedstawia najbardziej wzbogacone terminy biologiczne.
• Mapa organizuje wzbogacone terminy w sieć, która łączy geny w zestawy. Taka wizualizacja ułatwia identyfikację genów np. o podobnym znaczeniu biologicznym.
• Sieć przedstawia połączenia genów oraz pojęć biologicznych. Wykres pozwala na zobrazowanie złożoności biologicznej, w której każdy gen moze należeć do wielu kategorii.

Elementy komórkowe (CC)

Procesy biologiczne (BP)

Funkcje molekularne (MF)

Grupa GL vs Ova

Wykres Punktowy

Wykresy Analizy Ekspresji Genów (każda kropka charakteryzuje jeden gen).

Wykres typu Wulkan

Wykresy Analizy Ekspresji Genów (każda kropka charakteryzuje jeden gen).

Tabela

Tabele przedstawiają 10 genów, które wykazują najsilniejsze zmiany w poszczególnych porównaniach grup.

Wytłumaczenie danych zawartych w zbiorczych tabelach:

• baseMean - średnia ze znormalizowanych wartości zliczeń
• log2FoldChange - oszacowanie wielkości efektu. Zmienna ta mówi, jak bardzo ekspresja genu zmieniła się w jednej grupie w stosunku do drugiej. Wartość ta jest przedstawiona w skali logarytmicznej do podstawy 2: na przykład log2 krotność zmiany 1,5 oznacza, że ekspresja genu jest zwiększana przez współczynnik wynoszący 2^1,5, czyli w przybliżeniu zmiana wynosi 2,82.
• lfcSE - szacowana wartość błędu dla log2 fold change
• p-value - p wartość dla log2 fold change
• padj - skorygowana p wartość

Tabela z genami o obniżonej ekspresji

Tabela z genami o podwyższonej ekspresji

Szlak Sygnałowy

Szlak sygnałowy opisuje szereg życiowych procesów biochemicznych pochodzącymi zarówno z zewnątrz jak i wewnętrza komórki.

Przedstawione poniżej ścieżki sygnałowe pochodzą z bazy danych KEGG (ang. Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes). Ilustracje KEGG Pathway zawierają informacje na temat sieci komórkowych interakcji molekularnych i ich wariantów na podstawie publikacji naukowych.

Pełna nazwa szlaku sygnałowego znajduje się w lewym górym rogu.

Rodzaje KEGG Pathway:

• Metabolizm
• Przetwarzanie Informacji Genetycznej
• Przetwarzanie Informacji ze Środowiska
• Procesy na Poziomie Komórki
• Procesy na Poziomie Organizmu
• Procesy Chorobotwórcze
• Projektowanie Leków

Wykres szlaku sygnałowego wykonywany jest ręcznie w oprogramowanu o nazwie KegSketch. Domyślnie każda mapa stanowi interaktyny szablon. Referencyjne mapy KEGG Pathway oznaczone są kolorem białym. Zmiany przedstawiane są za pomocą palety kolorów, np. zielony i czerwony ozanczają kolejno zmiejszoną i zwiększoną ekspresję.

Interaktywną i szczegółową interpretację ścieżki KEGG można znaleźć w bazie KEGG Pathway po podaniu pełnej nazwy ścieżki lub ID.

Interpretacja KEGG

Podwyższona Ekspresja

Obniżona Ekspresja

Ontologia genów

Baza GO skupia całą dotychczasową wiedze o genach z podziałem na 3 domeny: elementy komórkowe (CC), funkcje molekularne genów (MF) oraz procesy biologiczne, w których uczestniczą (BP).
Ontologię genów stusuje się do lepszego zrozumienia procesów biologicznych czy też profilu funkcjonalnego zestawu genów ulegających zróżnicowanej ekspresji w badanych warunkach. Ontologia genów może być zwizualizowana w następujący sposób:

• Wykres słupkowy jest najczęściej stosowaną metodą wizualizacji wzbogaconych terminów.
• Wykres punktowy również przedstawia najbardziej wzbogacone terminy biologiczne.
• Mapa organizuje wzbogacone terminy w sieć, która łączy geny w zestawy. Taka wizualizacja ułatwia identyfikację genów np. o podobnym znaczeniu biologicznym.
• Sieć przedstawia połączenia genów oraz pojęć biologicznych. Wykres pozwala na zobrazowanie złożoności biologicznej, w której każdy gen moze należeć do wielu kategorii.

Elementy komórkowe (CC)

Procesy biologiczne (BP)

Funkcje molekularne (MF)

Grupa Con vs Ova

Wykres Punktowy

Wykresy Analizy Ekspresji Genów (każda kropka charakteryzuje jeden gen).

Wykres typu Wulkan

Wykresy Analizy Ekspresji Genów (każda kropka charakteryzuje jeden gen).

Tabela

Tabele przedstawiają 10 genów, które wykazują najsilniejsze zmiany w poszczególnych porównaniach grup.

Wytłumaczenie danych zawartych w zbiorczych tabelach:

• baseMean - średnia ze znormalizowanych wartości zliczeń
• log2FoldChange - oszacowanie wielkości efektu. Zmienna ta mówi, jak bardzo ekspresja genu zmieniła się w jednej grupie w stosunku do drugiej. Wartość ta jest przedstawiona w skali logarytmicznej do podstawy 2: na przykład log2 krotność zmiany 1,5 oznacza, że ekspresja genu jest zwiększana przez współczynnik wynoszący 2^1,5, czyli w przybliżeniu zmiana wynosi 2,82.
• lfcSE - szacowana wartość błędu dla log2 fold change
• p-value - p wartość dla log2 fold change
• padj - skorygowana p wartość

Tabela z genami o obniżonej ekspresji

Tabela z genami o podwyższonej ekspresji

Szlak Sygnałowy

Szlak sygnałowy opisuje szereg życiowych procesów biochemicznych pochodzącymi zarówno z zewnątrz jak i wewnętrza komórki.

Przedstawione poniżej ścieżki sygnałowe pochodzą z bazy danych KEGG (ang. Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes). Ilustracje KEGG Pathway zawierają informacje na temat sieci komórkowych interakcji molekularnych i ich wariantów na podstawie publikacji naukowych.

Pełna nazwa szlaku sygnałowego znajduje się w lewym górym rogu.

Rodzaje KEGG Pathway:

• Metabolizm
• Przetwarzanie Informacji Genetycznej
• Przetwarzanie Informacji ze Środowiska
• Procesy na Poziomie Komórki
• Procesy na Poziomie Organizmu
• Procesy Chorobotwórcze
• Projektowanie Leków

Wykres szlaku sygnałowego wykonywany jest ręcznie w oprogramowanu o nazwie KegSketch. Domyślnie każda mapa stanowi interaktyny szablon. Referencyjne mapy KEGG Pathway oznaczone są kolorem białym. Zmiany przedstawiane są za pomocą palety kolorów, np. zielony i czerwony ozanczają kolejno zmiejszoną i zwiększoną ekspresję.

Interaktywną i szczegółową interpretację ścieżki KEGG można znaleźć w bazie KEGG Pathway po podaniu pełnej nazwy ścieżki lub ID.

Interpretacja KEGG

Podwyższona Ekspresja

Obniżona Ekspresja

Ontologia genów

Baza GO skupia całą dotychczasową wiedze o genach z podziałem na 3 domeny: elementy komórkowe (CC), funkcje molekularne genów (MF) oraz procesy biologiczne, w których uczestniczą (BP).
Ontologię genów stusuje się do lepszego zrozumienia procesów biologicznych czy też profilu funkcjonalnego zestawu genów ulegających zróżnicowanej ekspresji w badanych warunkach. Ontologia genów może być zwizualizowana w następujący sposób:

• Wykres słupkowy jest najczęściej stosowaną metodą wizualizacji wzbogaconych terminów.
• Wykres punktowy również przedstawia najbardziej wzbogacone terminy biologiczne.
• Mapa organizuje wzbogacone terminy w sieć, która łączy geny w zestawy. Taka wizualizacja ułatwia identyfikację genów np. o podobnym znaczeniu biologicznym.
• Sieć przedstawia połączenia genów oraz pojęć biologicznych. Wykres pozwala na zobrazowanie złożoności biologicznej, w której każdy gen moze należeć do wielu kategorii.

Elementy komórkowe (CC)

Procesy biologiczne (BP)

Funkcje molekularne (MF)

4. Klastrowanie hierarchiczne

Hierarchiczne drzewo może wskazywać, które próbki są bardziej do siebie podobne w oparciu o znormalizowane wartości ekspresji genów. Bloki kolorów wskazują na strukturę danych i można oczekiwać, że powtórzenia będą klastrować się razem jako blok dla każdej grupy próbek. Ponadto spodziewamy się, że próbki będą grupowane podobnie do grup obserwowanych na wykresie PCA.

Wiersze i kolumny matrycy są przestawiane (niezależnie) zgodnie z wybraną metodą grupowania, tak aby geny lub grupy genów o podobnych wzorach ekspresyjnych sąsiadowały ze sobą. Obliczony dendrogram (drzewo) wynikający z grupowania jest dodany z boku obrazu, aby wskazać związki między genami.

metoda vst

metoda z-score

5. Analiza zróżnicowanej ekspresji

heatmapa

Na poniższym wykresie przedstawiono ekspresję 20 genów, które wykazują najmocniejsze zróżnicowanie pomiędzy badanymi grupami.

wykres pudełkowy

Analiza klastrowa pozwala na porównanie 10 genów o największej różnicy w ekspresji pomiędzy badanymi grupami.

Wybór Próbki

Grupa

Con GL Ova

 

Copyright © Genomika Polska

All rights reserved

Raport powstał na podstawie: Plotly, DataTables